Нанобиотехнологи ИОФ РАН и МФТИ уместили высокоточный анализ крови в обычную тест-полоску
Новая технология, основанная на использовании магнитных наночастиц сделает процедуру биохимического анализа жидкостей в разы более точной — и при этом такой же простой в применении, как тест на беременность
Исследователи из ИОФ РАН и МФТИ разработали новую биосенсорную тест-систему, основанную на применении магнитных наночастиц и предназначенную для очень точного измерения концентрации белковых молекул (например, так называемых «маркеров», которые указывают на начало или развитие заболеваний) в различных образцах, включая непрозрачные или сильно окрашенные жидкости. Исследование опубликовано в журнале Biosensors and Bioelectronics.
Новая разработка по своему принципу напоминает тест на беременность. Анализ проводится с помощью небольшой тест-полоски из пористого материала с двумя реакционными линиями. С одной из сторон наносится капля исследуемой жидкости; через некоторое время результат проявляется активацией либо одной, либо двух линий. Такая тест-полоска может долго храниться до использования. Проведение теста занимает мало времени, не требует специально обученного персонала, легко может проводиться рядом с пациентом и даже в полевых условиях.
Магнитные наночастицы на молекулярном уровне "сшиваются" с антителами к нужному белку, и затем их наносят на пористую пластину неподалеку от предполагаемого места контакта с изучаемым раствором. Жидкость, распространяясь по пластинке за счет капиллярного эффекта, захватывает магнитные частицы. Далее она встречает две линии - тестовую и контрольную. Тестовая содержит антитела, которые задерживают интересующий белок и заодно те магнитные метки, которые соединились с молекулами белка за счет того, что наночастицы тоже "сшиты" с антителами. А контрольная линия задерживает только антитела с магнитными метками, и она срабатывает в любом случае, если тест-полоска пригодна к использованию. Роль контрольной линии – показатель того, что тест пригоден к употреблению, что белковые антитела в его составе не разрушились от неправильного хранения и что анализируемая жидкость попала туда, куда надо.
Антиген - анализируемый белок (например, ПСА). MP - магнитная наночастица, висящий снизу Y - антитело к анализируемому белку. Тестовые антитела (голубые Y) задерживают анализируемый белок, а контрольные (желтые Y) - антитела вместе с наночастицами.
После того, как образец пропитал тест-полоску, и антитела провзаимодействовали друг с другом, можно считывать результат. На этом сходство с тестом на беременность заканчивается. В случае с "классическим" тестом на беременность результатом может быть либо «да», либо «нет». А разработанный тест позволяет не только выявить наличие белка с высокой чувствительностью, но и точно определить его концентрацию. Точность определения будет даже превосходить точность методов, которые выполняются только в лаборатории и только квалифицированным персоналом.
На полоску наносится капля исследуемой жидкости (1). Жидкость, распространяясь по полоске за счет капиллярного эффекта, захватывает магнитные частицы, которые “скреплены” с антителами к анализируемому белку (2). В процессе движения по полоске частицы связываются с нужным белком. Далее поток жидкости встречает две линии - тестовую (3) и контрольную (4). Тестовая содержит антитела, которые задерживают белок и заодно те магнитные метки, которые с ним соединились. Контрольная линия срабатывает в том случае, если тест-полоска пригодна к использованию. Изображение предоставлено пресс-центром МФТИ.
Ведущий автор исследования, Алексей Орлов, научный сотрудник ИОФ РАН (выпускник МФТИ 2010 года, закончил аспирантуру МФТИ в 2013) говорит:
«Традиционно тесты, которые можно проводить не только в условиях лаборатории, а даже в полевых условиях, основаны на применении флуоресцентных или окрашенных меток, а результаты определяются визуально, «на глазок» либо с помощью видеокамеры. Мы же используем магнитные частицы, которые обладают существенным преимуществом: с их помощью можно проводить анализ, даже окунув тест-полоску в полностью непрозрачную жидкость, скажем, определять вещества непосредственно в цельной крови. Точное численное измерение выполняется строго электронным способом с помощью портативного прибора. Ситуации «то ли да, то ли нет» абсолютно исключены».
Ученые отмечают, что наряду с высокой чувствительностью определения концентрации белка, новая тест-система позволяет проводить измерения в широком динамическом диапазоне: верхний порог определяемой концентрации превышает нижний более чем в 4000 раз.
Термин "динамический диапазон" знаком фотографам: применительно к фотоаппарату он обозначает способность матрицы или пленки различать градации яркости без засветки и без того, чтобы вовсе превращать картинку в темное пятно. Для биохимических измерений динамический диапазон подразумевает возможность измерять концентрацию белка как в очень разбавленном, так и очень насыщенном растворе.
Работу новой системы протестировали путем измерения в крови 0,025 нанограмм на миллилитр (при норме до 4 нанограмм) простат-специфического антигена - одного из наиболее массово контролируемых маркеров при диспансеризации мужчин.
Простат-специфический антиген, ПСА, является одним из возможных маркеров рака предстательной железы - а в криминалистике применяется для обнаружения следов семенной жидкости. Оба применения связаны с определенными ограничениями и не позволяют однозначно поставить диагноз/доказать вину подозреваемых, но возможности новой биосенсорной платформы не ограничиваются анализом ПСА; данный белок был выбран лишь для демонстрации.
Такая чувствительность определения ПСА достаточна, чтобы понять, не начался ли рецидив после удаления предстательной железы, и озвученные числа дают представление о потенциале разработки. Она способна не просто показать выход какого-либо показателя за пределы норматива, но и легко проследить за динамикой концентрации белковых маркеров заболеваний.
Сверив полученные новым методом результаты с “золотым стандартом” для определения ПСА - иммуноферментным анализом (ИФА), ученые убедились в корректности работы новой тест-системы и ее значительном превосходстве над традиционной технологией.
В новой тест-системе исследователи применили собственную запатентованную методику MPQ (англ. magnetic particle quantification) высокочувствительного подсчета магнитных наночастиц по нелинейному перемагничиванию, которая позволяет регистрировать от 60 зептомолей (приставка «зепто-» означает 10 в минус двадцать первой степени!) наночастиц в линейном диапазоне, превышающем десять миллионов раз. Достигнутые параметры не имеют мировых аналогов. Суть метода состоит в воздействии на наночастицы переменным магнитным полем на двух частотах и регистрации индукционного отклика на комбинаторных частотах.
Очень многие методы анализа веществ основаны на том, что изучаемые объекты, будь то частицы или молекулы, можно «раскачать» электромагнитным полем. При правильно подобранной частоте образец начинает либо активно поглощать излучение, либо излучать в ответ. В данном случае ученые использовали комбинацию двух частот магнитного поля и следили за откликом на частоте, которая является их линейной комбинацией — это и называют «комбинаторной» частотой.
Как сказал один из соавторов данного исследования, заведующий лабораторией нанобиотехнологий МФТИ, Максим Никитин:
«Ранее высокая чувствительность этого метода детекции магнитных частиц была продемонстрирована нами совместно с американскими исследователями из университета Чикаго при регистрации нашими сенсорами магнито-радиоактивных наночастиц на основе изотопа 59-Fe в организме животных in vivo (см. работу М. Nikitin et al., J.Appl. Phys. 2008, 103, 07A304). В частности, было установлено, что порог детекции с помощью упомянутого электронного метода совпадает с порогом регистрации по сопутствующему гамма-излучению, что позволяет заменить радиоактивные метки на магнитные наночастицы в целом ряде направлений биофизических исследований. В нынешней работе мы используем эту методологию, чтобы добиться сверхчувствительности уже для проведения иммуноанализа».
По словам руководителя исследований и заведующего лабораторией ИОФ РАН Петра Никитина (выпускника МФТИ 1979 г):
«Разработанные магнитные методы и регистраторы для считывания наномаркеров на тест-полосках позволяют не только обеспечивать упомянутые пределы и диапазоны измерения концентраций антигенов, но и эффективно контролировать все технологические этапы: от разработки и оптимизации протоколов иммуноанализа, до проведения и интерпретации результатов. Это, в частности, достигается путем количественного мониторинга перераспределения наномаркеров в процессе биохимических реакций вдоль всех составляющих 3D пористых компонентов тест-полосок, что не реализовывалось сих пор иными методами. Кроме того, используемые для синтеза магнитных наночастиц соли железа несравнимо доступнее и дешевле, чем реагенты для синтеза золотых наночастиц, наиболее распространённых в пороговых тестах типа теста на беременность».
Сочетание надежности, доступности и высокой точности с высокой чувствительностью позволяет рассчитывать на скорый переход разработки от лабораторного прототипа к серийному производству. Разработчики пока не называют конкретные сроки , но подчеркивают, что их тест-система может применяться не только для диагностики болезней, но также и в ряде других задач. Биосенсор позволит проводить анализы пищевых продуктов и лекарств, с его помощью можно будет проводить экологический мониторинг окружающей среды, и все это – прямо на месте, без сложных и дорогих приборов.
https://mipt.ru/newsblog/lenta/nanobiotekhnologi_iof_ran_i_mfti_umestili...